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A Metodologia do Phage Display

Tecnologia do phage display, descrita pela primeira vez por Scott & Smith em 1990. Oligonucleotídios sintéticos ou fragmentos de cDNA, tais como domínios Fab de  anticorpos, são clonados no genoma  de um bacteriófago filamentoso para formar uma biblioteca de fagos. Bilhões peptídios ou anticorpos diferentes estão representados numa biblioteca de phage display.

Vetores para phage display

 

 

 

Sobre a técnica

A técnica do Phage Display de peptídios utiliza bacteriófagos modificados por biologia molecular, de tal forma que cada partícula viral apresenta um polipeptídio exógeno na sua superfície (p.ex., um pequeno peptídio ou um fragmento de um anticorpo) (Figura acima). A coleção de fagos obtidos é, portanto, uma ‘biblioteca’ que pode conter bilhões de elementos diferentes. As bibliotecas de phage display são então utilizadas para isolar peptídios ou moléculas ligantes de receptores, enzimas, células ou tecidos.

O processo de seleção pode ser feito nas mais diversas condições. In vitro, utilizando enzimas e receptores purificados; numa suspensão de células, pela técnica BRASIL; ou mesmo injetando-se a biblioteca num camundongo de laboratório (ver as ilustrações ao lado). Nesse último caso, chamado de in vivo phage display, pode-se identificar marcadores moleculares expressos nos vasos sanguíneos dos diferentes órgãos (Pasqualini e Ruoslahti, 1996 e Arap et al., 2002). A metodologia do phage display é amplamente empregada em nosso laboratório para a identificação de novos marcadores vasculares.

Os pares receptores-ligantes identificados por phage display tem importantes aplicações em ciência e medicina. Os receptores podem ser validados como novos marcadores de doenças e os peptídios utilizados para o desenvolvimento racional de quimioterápicos, entre outras aplicações. Nosso objetivo é o de identificar marcadores moleculares de vasos sanguíneos, com a esperança de que esse conhecimento nos auxilie no desenvolvimento de novos e melhores agentes terapêuticos contras as diversas doenças com um componente angiogênico.

 

Método BRASIL

Seleção de fagos ligantes a células vivas feito pela metodologia BRASIL, que utiliza um sistema bifásico para separar células e fagos numa única etapa de centrifugação (Giordano et al, 2001).

 

Versatilidade da técnica do phage display. Peptídios ligantes de receptores expressos seletivamente nos vasos sanguíneos dos diferentes órgãos podem ser identificados pelo in vivo phage display. A biblioteca de fagos é injetada num camundongo. Após alguns minutos em circulação, os fagos ligantes dos vasos sanguíneos dos diferentes órgãos são isolados (Pasqualini e Ruoslahti, 1996). A técnica do phage display pode, também, ser combinado com a imortalização de células (Immortomouse) e a metodologia BRASIL. Estudos utilizando essas técnicas indicam que, mesmo em cultura, as células endoteliais preservam características moleculares (memória) do tecido de origem (Giordano et al., 2008).

  Biopanning